تشخیص محصولات جانبی واکنش جدید در اتوکلاو متقاطع BDDE

جاوا اسکریپت در حال حاضر در مرورگر شما غیر فعال است.هنگامی که جاوا اسکریپت غیرفعال است، برخی از عملکردهای این وب سایت کار نمی کنند.
خاویر فیدالگو، * پیر آنتوان دگلسن، * رودریگو آرویو، * لیلیان سپولودا، * اوگنیا رانوا، گروه علوم فیلیپ دپرز، گروه داروسازی فناوری پوست، کاستلو دی امپوریس، کاتالونیا، اسپانیا * این نویسندگان بینش هایی نسبت به این اثر دارند. سابقه مشارکت: اسید هیالورونیک (HA) یک پلی ساکارید طبیعی است که در تولید پرکننده های پوستی برای اهداف زیبایی شناختی استفاده می شود.از آنجایی که نیمه عمر آن در بافت های انسانی چند روز است، پرکننده های پوستی مبتنی بر HA از نظر شیمیایی اصلاح می شوند تا عمر خود را در بدن افزایش دهند.رایج ترین اصلاح در پرکننده های تجاری مبتنی بر HA، استفاده از 1،4-بوتاندیول دی گلیسیدیل اتر (BDDE) به عنوان یک عامل اتصال عرضی برای اتصال عرضی زنجیره های HA است.BDDE باقیمانده یا واکنش نداده در کمتر از 2 قسمت در میلیون (ppm) غیر سمی در نظر گرفته می شود.بنابراین، BDDE باقیمانده در پرکننده پوستی نهایی باید برای اطمینان از ایمنی بیمار اندازه گیری شود.مواد و روش‌ها: این مطالعه به توصیف و شناسایی یک محصول جانبی از واکنش اتصال متقابل بین BDDE و HA در شرایط قلیایی با ترکیب کروماتوگرافی مایع و طیف‌سنجی جرمی (LC-MS) می‌پردازد.یافته‌ها: پس از تجزیه و تحلیل‌های مختلف، مشخص شد که شرایط قلیایی و دمای بالا مورد استفاده برای ضدعفونی هیدروژل HA-BDDE باعث ایجاد این محصول جانبی جدید، ترکیب «شبه پروپیلن گلیکول» شده است.تجزیه و تحلیل LC-MS تأیید کرد که محصول جانبی دارای جرم مونوایزوتوپی مشابه BDDE، زمان ماند متفاوت (tR) و حالت جذب UV متفاوت (λ = 200 نانومتر) است.برخلاف BDDE، در آنالیز LC-MS مشاهده شد که تحت شرایط اندازه گیری یکسان، این محصول فرعی نرخ تشخیص بالاتری در 200 نانومتر دارد.نتیجه گیری: این نتایج نشان می دهد که در ساختار این ترکیب جدید اپوکسید وجود ندارد.این بحث برای ارزیابی خطر این محصول جانبی جدید که در تولید هیدروژل HA-BDDE (پرکننده پوستی HA) برای اهداف تجاری یافت می‌شود، باز است.کلمات کلیدی: اسید هیالورونیک، پرکننده پوستی HA، اسید هیالورونیک با پیوند متقابل، BDDE، آنالیز LC-MS، محصول جانبی BDDE.
پرکننده های مبتنی بر اسید هیالورونیک (HA) رایج ترین و محبوب ترین پرکننده های پوستی هستند که برای اهداف زیبایی استفاده می شوند.1 این پرکننده پوستی یک هیدروژل است که معمولاً از بیش از 95٪ آب و 0.5-3٪ HA تشکیل شده است که ساختاری ژل مانند به آنها می دهد.2 HA یک پلی ساکارید و جزء اصلی ماتریکس خارج سلولی مهره داران است.یکی از مواد تشکیل دهنده.این شامل (1،4)-گلوکورونیک اسید-β (1،3)-N-استیل گلوکزامین (GlcNAc) واحدهای دی ساکارید تکرار شونده با پیوندهای گلیکوزیدی است.این الگوی دی ساکارید در همه موجودات یکسان است.در مقایسه با برخی از پرکننده های مبتنی بر پروتئین (مانند کلاژن)، این خاصیت HA را به یک مولکول بسیار زیست سازگار تبدیل می کند.این پرکننده ها می توانند ویژگی توالی آمینو اسیدی را نشان دهند که ممکن است توسط سیستم ایمنی بیمار تشخیص داده شود.
هنگامی که به عنوان یک پرکننده پوست استفاده می شود، محدودیت اصلی HA گردش سریع آن در بافت ها به دلیل حضور یک خانواده خاص از آنزیم ها به نام هیالورونیداز است.تاکنون چندین تغییر شیمیایی در ساختار HA برای افزایش نیمه عمر HA در بافت ها شرح داده شده است.اکثر این اصلاحات تلاش می کنند تا دسترسی هیالورونیداز به پلیمرهای پلی ساکارید را با اتصال زنجیره های HA کاهش دهند.بنابراین، به دلیل تشکیل پل ها و پیوندهای کووالانسی بین مولکولی بین ساختار HA و عامل اتصال عرضی، هیدروژل HA با پیوند متقابل، محصولات ضد تجزیه آنزیمی بیشتری نسبت به HA طبیعی تولید می کند.4-6
تا کنون، عوامل اتصال عرضی شیمیایی مورد استفاده برای تولید HA متقابل شامل متاکریلامید، 7 هیدرازید، 8 کربودی ایمید، 9 دی وینیل سولفون، 1،4-بوتاندیول دی گلیسیدیل اتر (BDDE) و پلی (اتیلن گلیکول) دی گلیسیدیل اتر می باشد.10،11 BDDE در حال حاضر رایج ترین عامل اتصال عرضی است.اگرچه این نوع هیدروژل ها برای چندین دهه ثابت شده است که ایمن هستند، عوامل اتصال عرضی مورد استفاده، معرف های واکنشی هستند که ممکن است سیتوتوکسیک و در برخی موارد جهش زا باشند.بنابراین، مقدار باقیمانده آنها در هیدروژل نهایی باید زیاد باشد.BDDE زمانی ایمن در نظر گرفته می شود که غلظت باقیمانده کمتر از 2 قسمت در میلیون (ppm) باشد.4
روش های مختلفی برای تشخیص غلظت کم باقیمانده BDDE، درجه اتصال متقابل و موقعیت جایگزینی در هیدروژل های HA وجود دارد، مانند کروماتوگرافی گازی، کروماتوگرافی حذف اندازه همراه با طیف سنجی جرمی (MS)، روش های اندازه گیری فلورسانس رزونانس مغناطیسی هسته ای (NMR) و کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا با آرایه دیودی (HPLC).13-17 این مطالعه تشخیص و شناسایی یک محصول جانبی را در هیدروژل HA با پیوند متقابل نهایی تولید شده توسط واکنش BDDE و HA در شرایط قلیایی توصیف می کند.HPLC و کروماتوگرافی مایع - طیف سنجی جرمی (تجزیه و تحلیل LC-MS).از آنجایی که سمیت این محصول جانبی BDDE ناشناخته است، توصیه می کنیم که کمیت باقیمانده آن باید به روشی مشابه با روشی که معمولاً روی BDDE در محصول نهایی انجام می شود تعیین شود.
نمک سدیم بدست آمده از HA (شرکت Shiseido، آموزشی ویبولیتین، توکیو، ژاپن) دارای وزن مولکولی ~ 1368000 دا (روش لورن) 18 و ویسکوزیته ذاتی 2.20 متر مکعب بر کیلوگرم است.برای واکنش اتصال عرضی، BDDE (≥95٪) از شرکت Sigma-Aldrich (سنت لوئیس، MO، ایالات متحده آمریکا) خریداری شد.سالین بافر فسفات با pH 7.4 از شرکت سیگما آلدریچ خریداری شد.تمام حلال ها، استونیتریل و آب مورد استفاده در آنالیز LC-MS از کیفیت درجه HPLC خریداری شدند.اسید فرمیک (98٪) به عنوان درجه معرف خریداری می شود.
تمام آزمایش‌ها بر روی یک سیستم UPLC Acquity (واترز، میلفورد، MA، ایالات متحده آمریکا) انجام شد و به یک طیف‌سنج جرمی چهار قطبی سه‌گانه API 3000 مجهز به منبع یونیزاسیون الکترواسپری (AB SCIEX، Framingham، MA، ایالات متحده) متصل شد.
سنتز هیدروژل های HA با پیوند متقابل با افزودن 198 میلی گرم BDDE به محلول 10 درصد (وزنی/وزنی) هیالورونات سدیم (NaHA) در حضور 1 درصد قلیایی (هیدروکسید سدیم، NaOH) آغاز شد.غلظت نهایی BDDE در مخلوط واکنش 9.9 میلی گرم بر میلی لیتر (0.049 میلی مولار) بود.سپس مخلوط واکنش کاملاً مخلوط و همگن شده و اجازه داده شد تا در دمای 45 درجه سانتیگراد به مدت 4 ساعت ادامه یابد.19 pH واکنش در 12 ~ حفظ می شود.
پس از آن، مخلوط واکنش با آب شسته شد و هیدروژل HA-BDDE نهایی فیلتر و با بافر PBS رقیق شد تا غلظت HA 10 تا 25 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر و pH نهایی 7.4 به دست آید.به منظور استریل کردن هیدروژل های HA با پیوند متقابل تولید شده، تمام این هیدروژل ها اتوکلاو می شوند (120 درجه سانتی گراد به مدت 20 دقیقه).هیدروژل BDDE-HA خالص شده تا زمان تجزیه و تحلیل در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری می شود.
برای تجزیه و تحلیل BDDE موجود در محصول HA دارای پیوند متقابل، یک نمونه 240 میلی گرمی وزن شده و به سوراخ مرکزی (Microcon®؛ Merck Millipore, Billerica, MA, USA؛ حجم 0.5 میلی لیتر) وارد شد و با سرعت 10000 دور در دقیقه در دمای اتاق سانتریفیوژ شد. 10 دقیقه.در مجموع 20 میکرولیتر مایع pull-down جمع آوری و آنالیز شد.
به منظور آنالیز استاندارد BDDE (Sigma-Aldrich Co) در شرایط قلیایی (1٪، 0.1٪ و 0.01٪ NaOH)، در صورت رعایت شرایط زیر، نمونه مایع 1:10، 1:100 یا حداکثر است. 1:1،000،000 در صورت لزوم، از آب دیونیزه شده MilliQ برای تجزیه و تحلیل استفاده کنید.
برای مواد اولیه مورد استفاده در واکنش اتصال متقابل (HA 2٪، H2O، 1٪ NaOH، و 0.049 میلی مولار BDDE)، 1 میلی لیتر از هر نمونه تهیه شده از این مواد با استفاده از همان شرایط آنالیز آنالیز شد.
برای تعیین ویژگی پیک های ظاهر شده در نقشه یونی، 10 میکرولیتر محلول استاندارد BDDE ppb 100 (Sigma-Aldrich Co) به نمونه 20 میکرولیتری اضافه شد.در این حالت غلظت نهایی استاندارد در هر نمونه ppb 37 می باشد.
ابتدا یک محلول استوک BDDE با غلظت 11000 میلی گرم در لیتر (11000 پی پی ام) با رقیق کردن 10 میکرولیتر BDDE استاندارد (Sigma-Aldrich Co) با 990 میکرولیتر آب MilliQ (چگالی 1.1 گرم در میلی لیتر) تهیه کنید.از این محلول برای تهیه محلول BDDE 110 میکروگرم در لیتر (ppb 110) به عنوان رقت استاندارد متوسط ​​استفاده کنید.سپس از رقیق کننده استاندارد BDDE متوسط ​​(ppb 110) برای تهیه منحنی استاندارد با رقیق کردن رقیق کننده میانی چندین بار استفاده کنید تا به غلظت مطلوب 75، 50، 25، 10 و 1 ppb برسید.همانطور که در شکل 1 نشان داده شده است، مشخص شده است که منحنی استاندارد BDDE از 1.1 تا 110 ppb خطی خوبی دارد (R2>0.99).منحنی استاندارد در چهار آزمایش مستقل تکرار شد.
شکل 1 منحنی کالیبراسیون استاندارد BDDE که با تجزیه و تحلیل LC-MS به دست آمده است، که در آن همبستگی خوبی مشاهده می شود (R2>0.99).
اختصارات: BDDE، 1،4-butanediol diglycidyl ether.LC-MS، کروماتوگرافی مایع و طیف سنجی جرمی.
به منظور شناسایی و تعیین کمیت استانداردهای BDDE موجود در HA با پیوند متقابل و استانداردهای BDDE در محلول پایه، از آنالیز LC-MS استفاده شد.
جداسازی کروماتوگرافی بر روی ستون LUNA 2.5 میکرومتر C18(2)-HST (50×2.0 mm2؛ Phenomenex، Torrance، CA، USA) به دست آمد و در طول آنالیز در دمای اتاق (25 درجه سانتیگراد) نگهداری شد.فاز متحرک شامل استونیتریل (حلال A) و آب (حلال B) حاوی 0.1٪ اسید فرمیک است.فاز متحرک با شستشوی گرادیان شسته می شود.گرادیان به شرح زیر است: 0 دقیقه، 2% A;1 دقیقه، 2% A;6 دقیقه، 98% A;7 دقیقه، 98% A;7.1 دقیقه، 2% A;10 دقیقه، 2% A. زمان اجرا 10 دقیقه و حجم تزریق 20 میکرولیتر است.زمان ماندگاری BDDE حدود 3.48 دقیقه (از 3.43 تا 4.14 دقیقه بر اساس آزمایشات) است.فاز متحرک با سرعت جریان 0.25 میلی لیتر در دقیقه برای تجزیه و تحلیل LC-MS پمپ شد.
برای تجزیه و تحلیل BDDE و تعیین کمیت توسط MS، سیستم UPLC (Waters) با یک طیف‌سنج جرمی چهار قطبی سه‌گانه API 3000 (AB SCIEX) مجهز به منبع یونیزاسیون الکترواسپری ترکیب می‌شود و آنالیز در حالت یون مثبت (ESI+) انجام می‌شود.
با توجه به تجزیه قطعه یونی انجام شده بر روی BDDE، قطعه با بیشترین شدت قطعه مربوط به 129.1 Da تعیین شد (شکل 6).بنابراین، در حالت نظارت چند یونی (MIM) برای تعیین کمیت، تبدیل جرم (نسبت جرم به شارژ [m/z]) BDDE 203.3/129.1 Da است.همچنین از حالت اسکن کامل (FS) و حالت اسکن یون محصول (PIS) برای تجزیه و تحلیل LC-MS استفاده می کند.
به منظور تأیید ویژگی روش، یک نمونه خالی (فاز متحرک اولیه) مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.هیچ سیگنالی در نمونه خالی با تبدیل جرمی 203.3/129.1 Da شناسایی نشد.با توجه به تکرارپذیری آزمایش، 10 تزریق استاندارد ppb 55 (در وسط منحنی کالیبراسیون) مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت که منجر به انحراف استاندارد باقیمانده (RSD) <5٪ (داده‌ها نشان داده نشده است).
محتوای باقیمانده BDDE در هشت هیدروژل HA با اتصال متقابل اتوکلاو BDDE که مربوط به چهار آزمایش مستقل است، اندازه‌گیری شد.همانطور که در بخش "مواد و روش ها" توضیح داده شد، کمی سازی با مقدار متوسط ​​منحنی رگرسیون رقت استاندارد BDDE ارزیابی می شود، که مربوط به پیک منحصر به فرد شناسایی شده در انتقال جرم BDDE 203.3/129.1 Da، با احتباس است. زمان 3.43 تا 4.14 دقیقه منتظر نشدن.شکل 2 نمونه ای از کروماتوگرام استاندارد مرجع BDDE 10 ppb را نشان می دهد.جدول 1 محتوای باقیمانده BDDE هشت هیدروژل مختلف را خلاصه می کند.محدوده مقدار 1 تا 2.46 ppb است.بنابراین، غلظت باقیمانده BDDE در نمونه برای استفاده انسانی قابل قبول است (<2ppm).
شکل 2 کروماتوگرام یونی 10 ppb استاندارد مرجع BDDE (Sigma-Aldrich Co)، انتقال MS (m/z) به دست آمده با تجزیه و تحلیل LC-MS 203.30/129.10 Da (در حالت MRM مثبت).
اختصارات: BDDE، 1،4-butanediol diglycidyl ether.LC-MS، کروماتوگرافی مایع و طیف سنجی جرمی.MRM، نظارت بر واکنش چندگانه؛ام اس، توده؛m/z، نسبت جرم به شارژ.
نکته: نمونه های 1-8 هیدروژل های HA با اتصال متقاطع BDDE اتوکلاو شده هستند.مقدار باقیمانده BDDE در هیدروژل و اوج زمان ماند BDDE نیز گزارش شده است.در نهایت وجود پیک های جدید با زمان های ماند متفاوت نیز گزارش شده است.
اختصارات: BDDE، 1،4-butanediol diglycidyl ether.HA، اسید هیالورونیک؛MRM، نظارت بر واکنش چندگانه؛tR، زمان ماند.LC-MS، کروماتوگرافی مایع و طیف سنجی جرمی.RRT، زمان ماندگاری نسبی.
با کمال تعجب، تجزیه و تحلیل کروماتوگرام یونی LC-MS نشان داد که بر اساس تمام نمونه‌های هیدروژل HA با پیوند متقاطع اتوکلاو تجزیه‌وتحلیل‌شده، یک پیک اضافی در زمان ماند کوتاه‌تر 2.73 تا 3.29 دقیقه وجود داشت.به عنوان مثال، شکل 3 کروماتوگرام یونی یک نمونه HA با پیوند متقابل را نشان می دهد، که در آن یک پیک اضافی در زمان ماند متفاوت تقریباً 2.71 دقیقه ظاهر می شود.زمان ماند نسبی مشاهده شده (RRT) بین پیک تازه مشاهده شده و پیک از BDDE 0.79 بود (جدول 1).از آنجایی که ما می دانیم که اوج تازه مشاهده شده در ستون C18 مورد استفاده در تجزیه و تحلیل LC-MS کمتر حفظ می شود، پیک جدید ممکن است با یک ترکیب قطبی تر از BDDE مطابقت داشته باشد.
شکل 3 کروماتوگرام یونی نمونه هیدروژل HA با پیوند متقابل بدست آمده توسط LC-MS (تبدیل جرم MRM 203.3/129.0 Da).
اختصارات: HA، اسید هیالورونیک؛LC-MS، کروماتوگرافی مایع و طیف سنجی جرمی.MRM، نظارت بر واکنش چندگانه؛RRT، زمان ماند نسبی.tR، زمان ماندگاری
به منظور رد این احتمال که پیک های جدید مشاهده شده ممکن است آلاینده هایی باشند که در اصل در مواد خام مورد استفاده وجود دارند، این مواد خام نیز با استفاده از همان روش تحلیل LC-MS مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند.مواد اولیه مورد تجزیه و تحلیل شامل آب، 2٪ NaHA در آب، 1٪ NaOH در آب، و BDDE در همان غلظت مورد استفاده در واکنش اتصال متقابل است.کروماتوگرام یونی ماده اولیه مورد استفاده هیچ ترکیب یا پیکی را نشان نداد و زمان ماند آن با پیک جدید مشاهده شده مطابقت دارد.این واقعیت این ایده را نادیده می گیرد که نه تنها ماده اولیه ممکن است حاوی ترکیبات یا موادی باشد که ممکن است در فرآیند تجزیه و تحلیل تداخل داشته باشد، بلکه هیچ نشانه ای از آلودگی متقابل احتمالی با سایر محصولات آزمایشگاهی وجود ندارد.مقادیر غلظت بدست آمده پس از تجزیه و تحلیل LC-MS BDDE و پیک های جدید در جدول 2 (نمونه های 1-4) و کروماتوگرام یونی در شکل 4 نشان داده شده است.
نکته: نمونه های 1-4 مربوط به مواد خام مورد استفاده برای تولید هیدروژل های HA با اتصال عرضی BDDE اتوکلاو شده است.این نمونه ها اتوکلاو نشدند.
اختصارات: BDDE، 1،4-butanediol diglycidyl ether.HA، اسید هیالورونیک؛LC-MS، کروماتوگرافی مایع و طیف سنجی جرمی.MRM، نظارت بر واکنش چندگانه.
شکل 4 مربوط به کروماتوگرام LC-MS نمونه ای از مواد خام مورد استفاده در واکنش اتصال متقابل HA و BDDE است.
توجه: همه اینها در غلظت و نسبت یکسانی که برای انجام واکنش پیوند متقابل استفاده می شود اندازه گیری می شوند.اعداد مواد خام مورد تجزیه و تحلیل با کروماتوگرام مطابق با: (1) آب، (2) محلول آبی 2٪ HA، (3) محلول آبی 1٪ NaOH است.تجزیه و تحلیل LC-MS برای تبدیل جرم 203.30/129.10 Da (در حالت MRM مثبت) انجام می شود.
اختصارات: BDDE، 1،4-butanediol diglycidyl ether.HA، اسید هیالورونیک؛LC-MS، کروماتوگرافی مایع و طیف سنجی جرمی.MRM، نظارت بر واکنش چندگانه.
شرایطی که منجر به تشکیل قله های جدید شد مورد مطالعه قرار گرفت.به منظور بررسی اینکه چگونه شرایط واکنش مورد استفاده برای تولید هیدروژل HA دارای پیوند متقابل بر واکنش‌پذیری عامل پیوند متقابل BDDE تأثیر می‌گذارد که منجر به تشکیل پیک‌های جدید (محصولات جانبی احتمالی) می‌شود، اندازه‌گیری‌های مختلفی انجام شد.در این تعیین‌ها، ما اتصال‌دهنده نهایی BDDE را مطالعه و آنالیز کردیم که با غلظت‌های مختلف NaOH (0٪، 1٪، 0.1٪ و 0.01٪) در محیط آبی و به دنبال آن یا بدون اتوکلاو تیمار شد.روش باکتری برای شبیه سازی شرایط مشابه همان روشی است که برای تولید هیدروژل HA با پیوند متقابل استفاده می شود.همانطور که در بخش "مواد و روش ها" توضیح داده شد، انتقال جرم نمونه با LC-MS به 203.30/129.10 Da تجزیه و تحلیل شد.BDDE و غلظت پیک جدید محاسبه شده و نتایج در جدول 3 نشان داده شده است. بدون توجه به وجود NaOH در محلول، هیچ پیک جدیدی در نمونه‌هایی که اتوکلاو نشده‌اند شناسایی نشد (نمونه‌های 1-4، جدول). 3).برای نمونه های اتوکلاو شده، پیک های جدید فقط در حضور NaOH در محلول شناسایی می شوند و به نظر می رسد تشکیل پیک به غلظت NaOH در محلول بستگی دارد (نمونه های 5-8، جدول 3) (RRT = 0.79).شکل 5 نمونه ای از کروماتوگرام یونی را نشان می دهد که دو نمونه اتوکلاو شده را در حضور یا عدم حضور NAOH نشان می دهد.
اختصارات: BDDE، 1،4-butanediol diglycidyl ether.LC-MS، کروماتوگرافی مایع و طیف سنجی جرمی.MRM، نظارت بر واکنش چندگانه.
نکته: کروماتوگرام بالا: نمونه با محلول آبی سدیم 1/0 درصد تیمار شده و در اتوکلاو (120 درجه سانتی گراد به مدت 20 دقیقه) قرار گرفت.کروماتوگرام پایین: نمونه با NaOH تیمار نشد، اما در شرایط یکسان اتوکلاو شد.تبدیل جرم 203.30/129.10 Da (در حالت MRM مثبت) توسط LC-MS آنالیز شد.
اختصارات: BDDE، 1،4-butanediol diglycidyl ether.LC-MS، کروماتوگرافی مایع و طیف سنجی جرمی.MRM، نظارت بر واکنش چندگانه.
در تمام نمونه های اتوکلاو شده، با یا بدون NaOH، غلظت BDDE به شدت کاهش یافت (تا 16.6 برابر) (نمونه های 5-8، جدول 2).کاهش غلظت BDDE ممکن است به این دلیل باشد که در دماهای بالا، آب می تواند به عنوان یک پایه (نوکلئوفیل) عمل کند تا حلقه اپوکسید BDDE را باز کند و یک ترکیب 1،2-دیول تشکیل دهد.کیفیت تک ایزوتوپی این ترکیب با BDDE متفاوت است و بنابراین تحت تأثیر قرار نخواهد گرفت.LC-MS یک تغییر جرم 203.30/129.10 Da را شناسایی کرد.
در نهایت، این آزمایش ها نشان می دهد که تولید پیک های جدید به حضور BDDE، NAOH و فرآیند اتوکلاو بستگی دارد، اما هیچ ارتباطی با HA ندارد.
پیک جدید یافت شده در زمان ماند تقریباً 2.71 دقیقه با LC-MS مشخص شد.برای این منظور، BDDE (9.9 میلی گرم بر میلی لیتر) در محلول آبی سدیم 1 درصد انکوبه و اتوکلاو شد.در جدول 4، ویژگی های پیک جدید با پیک مرجع شناخته شده BDDE (زمان ماند تقریباً 3.47 دقیقه) مقایسه شده است.بر اساس تجزیه و تحلیل تکه تکه شدن یون دو پیک، می توان نتیجه گرفت که پیک با زمان ماند 2.72 دقیقه قطعاتی مشابه پیک BDDE اما با شدت های متفاوت را نشان می دهد (شکل 6).برای پیک مربوط به زمان ماند (PIS) 2.72 دقیقه، پیک شدیدتری پس از تکه تکه شدن در جرم 147 Da مشاهده شد.در غلظت BDDE (9.9 mg/mL) مورد استفاده در این تعیین، حالت های جذب مختلف (UV، λ=200 نانومتر) در طیف فرابنفش نیز پس از جداسازی کروماتوگرافی مشاهده شد (شکل 7).پیک با زمان ماند 2.71 دقیقه هنوز در 200 نانومتر قابل مشاهده است، در حالی که پیک BDDE را نمی توان در کروماتوگرام در شرایط مشابه مشاهده کرد.
جدول 4 نتایج خصوصیات پیک جدید با زمان ماند حدود 2.71 دقیقه و پیک BDDE با زمان ماند 3.47 دقیقه
نکته: برای به دست آوردن این نتایج، آنالیزهای LC-MS و HPLC (MRM و PIS) روی دو پیک انجام شد.برای آنالیز HPLC از تشخیص UV با طول موج 200 نانومتر استفاده می شود.
اختصارات: BDDE، 1،4-butanediol diglycidyl ether.HPLC، کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا؛LC-MS، کروماتوگرافی مایع و طیف سنجی جرمی.MRM، نظارت بر واکنش چندگانه؛m/z، نسبت جرم به شارژ؛PIS، اسکن یون محصول؛نور ماوراء بنفش، نور ماوراء بنفش.
توجه: قطعات جرمی با تجزیه و تحلیل LC-MS (PIS) به دست می آیند.کروماتوگرام بالا: طیف جرمی قطعات نمونه استاندارد BDDE.کروماتوگرام پایین: طیف جرمی پیک جدید شناسایی شده (RRT مرتبط با پیک BDDE 0.79 است).BDDE در محلول NaOH 1% پردازش و اتوکلاو شد.
اختصارات: BDDE، 1،4-butanediol diglycidyl ether.LC-MS، کروماتوگرافی مایع و طیف سنجی جرمی.MRM، نظارت بر واکنش چندگانه؛PIS، اسکن یون محصول؛RRT، زمان ماندگاری نسبی.
شکل 7 کروماتوگرام یونی یون پیش ساز 203.30 Da، و (الف) پیک جدید با زمان ماند 2.71 دقیقه و (B) تشخیص UV پیک استاندارد مرجع BDDE در 3.46 دقیقه در 200 نانومتر.
در تمام هیدروژل‌های HA با پیوند متقابل تولید شده، مشاهده شد که غلظت باقی‌مانده BDDE پس از کمی‌سازی LC-MS کمتر از 2ppm بود، اما یک اوج ناشناخته جدید در تجزیه و تحلیل ظاهر شد.این پیک جدید با محصول استاندارد BDDE مطابقت ندارد.محصول استاندارد BDDE نیز در حالت مثبت MRM مورد تجزیه و تحلیل کیفیت مشابه (تبدیل MRM 203.30/129.10 Da) قرار گرفته است.به طور کلی، سایر روش های تحلیلی مانند کروماتوگرافی به عنوان آزمایش های حد برای تشخیص BDDE در هیدروژل ها استفاده می شود، اما حداکثر حد تشخیص (LOD) کمی کمتر از 2 ppm است.از سوی دیگر، تا کنون، NMR و MS برای مشخص کردن درجه پیوند متقابل و/یا اصلاح HA در قطعات واحد قند محصولات HA با پیوند متقابل استفاده شده‌اند.هدف از این تکنیک ها هرگز تعیین کمیت تشخیص BDDE باقیمانده در چنین غلظت های پایینی که در این مقاله توضیح دادیم نبوده است (LOD روش LC-MS ما = ppb 10).